Hydrofob kolonnkromatografi

Hydrofob interaktionskromatografi(HIC) är en kraftfull teknik som främst används i separationen och rening av proteiner, särskilt de som har hydrofoba egenskaper. Denna kromatografiska metod utnyttjar de differentiella hydrofoba interaktionerna mellan provmolekyler och den stationära fasen, vilket möjliggör separering av komponenter baserat på deras migrationshastigheter under eluering med den mobila fasen. I denna omfattande artikel kommer vi att fördjupa oss i principerna, drift, tillämpningar, fördelar, nackdelar och de senaste framstegen av hydrofob interaktionskromatografi.

Grunden för HIC ligger i de hydrofoba interaktionerna mellan proteinmolekyler och de hydrofoba liganderna fästa vid den stationära fasen. Proteiner, som är amfipatisk till sin natur, innehåller både hydrofila och hydrofoba rester. I vattenhaltiga lösningar tenderar hydrofila rester att vända sig utåt och interagera med vattenmolekyler, medan hydrofoba rester ofta begravas i proteinets tertiära struktur. Under vissa förhållanden, såsom närvaron av höga saltkoncentrationer, kan dessa hydrofoba rester emellertid bli utsatta, vilket främjar deras interaktion med de hydrofoba liganderna på den kromatografiska matrisen.

Den mobila fasen i HIC består vanligtvis av en buffrad saltlösning med ett pH -intervall av 6-8. Höga saltkoncentrationer används för att förbättra de hydrofoba interaktioner, vilket underlättar bindningen av proteiner till den stationära fasen. Gradvis reduktion av saltkoncentration i den mobila fasen under eluering ökar tvättkraften, vilket gör att proteiner kan elueras baserat på deras hydrofobicitet. Proteiner med svagare hydrofoba interaktioner elueras först, följt av de med starkare interaktioner.

Metodiken för hydrofob kolonnkromatografi involverar flera avgörande steg, inklusive provberedning, kolonnjämvikt, laddning av provet, eluering och insamling av fraktioner.

◆ Provförberedelser:
Innan provet laddas på kolonnen är det avgörande att framställa provet genom att tillsätta tillräckligt salt för att matcha saltkoncentrationen för den mobila fasen A (jämviktsbuffert). PH för provlösningen bör också justeras för att uppfylla adsorptionsförhållandena.

◆ Kolumn jämvikt:
Kolonnen är jämviktad med mobil fas A, som är en buffrad saltlösning av en specifik pH och saltkoncentration. Detta säkerställer att den stationära fasen är mättad med bufferten, redo att interagera med provproteinerna.

◆ Laddar provet:
Det beredda provet laddas på kolonnen. Provets volym påverkas av komponentkoncentrationen och medias bindningskapacitet. För utspädda prover är direkt belastning möjlig utan föregående koncentration.

◆ Eventuering:
Eluering uppnås genom att gradvis minska saltkoncentrationen av den mobila fasen och därmed försvaga de hydrofoba interaktionerna mellan proteinerna och den stationära fasen. Alternativt kan eluering uppnås genom att tillsätta organiska lösningsmedel eller tvättmedel till den mobila fasen för att förändra dess polaritet eller för att förskjuta de bundna proteinerna.

◆ Samling av bråkdelar:
De eluerade fraktionerna samlas in och analyseras för att bedöma renheten och återhämtningen av målproteinerna.

Flera faktorer påverkar signifikant separationseffektiviteten och renheten hos proteiner i hydrofob kolonnkromatografi:

◆ Saltkoncentration och typ:
Typen och koncentrationen av salt i mobilfasen spelar en viktig roll för att modulera hydrofoba interaktioner. Salter såsom ammoniumsulfat och natriumklorid används vanligtvis, med koncentrationer som sträcker sig från 0. 75 till 2 mol/L för ammoniumsulfat och 1 till 4 mol/L för natriumklorid.

◆ PH:
Den mobila fasen påverkar laddningstillståndet och hydrofobiciteten hos proteiner. Ett pH bort från proteinens isoelektriska punkt tenderar att gynna eluering genom att minska de hydrofoba interaktionerna.

◆ Temperatur:
Att öka kolonntemperaturen kan förbättra hydrofoba interaktioner, vilket leder till förbättrad separationseffektivitet.

◆ Flödeshastighet:
Flödeshastigheten påverkar proteinernas uppehållstid i kolonnen, vilket påverkar deras interaktion med den stationära fasen.

◆ Kolumnegenskaper:
Längden, diametern och förpackningsmaterialet i kolonnen bidrar alla till separationseffektiviteten. Valet av stationärt fasmaterial och dess ytegenskaper är också kritiska.

HIC finner omfattande applicering vid rening av olika proteiner, inklusive serumproteiner, membranbundna proteiner, kärnproteiner, receptorer och rekombinanta proteiner. Dess milda separationsbetingelser gör det särskilt lämpligt för rening av aktiva ämnen, såsom enzymer, antikroppar och andra terapeutiska proteiner.

Fördelar:

1) Hög återhämtningshastigheter: HIC erbjuder höga återhämtningshastigheter av proteiner, vilket gör det effektivt för storskaliga reningsprocesser.

2) Underhållen proteinaktivitet: De milda separationsbetingelserna minimerar protein denaturering och förlust av aktivitet.

3) Mångsidighet: HIC kan anpassas för rening av ett brett spektrum av proteiner med olika hydrofoba egenskaper.

Nackdelar:

1) Begränsad löslighet: Vissa proteiner kan uppvisa reducerad löslighet vid höga saltkoncentrationer, vilket begränsar deras användbarhet i HIC.

2) Saltstörningar: höga saltkoncentrationer i den mobila fasen kan störa efterföljande analytiska steg, vilket kräver ytterligare avsaltningsförfaranden.

De senaste framstegen inom HIC har fokuserat på utvecklingen av nya kromatografiska matriser med förbättrad separationseffektivitet och stabilitet. Inkorporering av hydrofil interaktionskromatografi (HILIC) -principer och användning av blandat läge hartser har utvidgat användbarheten av HIC till separationen av polära föreningar.

Dessutom har integrationen av HIC med andra kromatografiska tekniker, såsom jonbyteskromatografi eller storleksuteslutningskromatografi, underlättat utvecklingen av effektivare och robusta reningsprotokoll. Framstegen inom automatisering och screeningtekniker med hög genomströmning har också bidragit till skalbarheten och reproducerbarheten av HIC-processer.

Framtida riktningar i HIC -forskning inkluderar utforskning av alternativa ligander och matriser för att ytterligare förbättra separationseffektiviteten och bredda tillämpningsområdet. Utvecklingen av mer miljövänliga och hållbara mobilfaser, liksom optimering av elueringsförhållanden för att minimera protein denaturering, förblir områden för pågående forskning.

Sammanfattningsvis representerar hydrofob interaktionskromatografi ett mångsidigt och effektivt verktyg för separering och rening av proteiner, särskilt de med hydrofoba egenskaper. Genom att utnyttja de differentiella hydrofoba interaktionerna mellan provmolekyler och den stationära fasen möjliggör HIC rening av högkvalitativa proteiner för olika terapeutiska, diagnostiska och forskningsapplikationer. Med pågående framsteg inom kromatografiska material, automatisering och integration med andra tekniker, lovar HIC: s framtid ännu större effektivitet och bredare tillämpbarhet inom biofarmaceutiska områden.

Populära Taggar: Hydrofob kolonnkromatografi, Kina hydrofob kolonnkromatografitillverkare, leverantörer, fabrik